A quantificação de fluorose em ratos, principalmente em alterações discretas, ainda é um desafio. Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver um índice sensível para quantificar a fluorose em incisivos de ratos baseado na alteração da pigmentação de ferro causada por fluoreto (F) na superfície do esmalte dental de ratos. Trinta e cinco ratas de 35 dias de idade, receberam água com concentrações crescentes de F: 0; 12,5; 25; 50; 62,5; 75 ou 100 μg F/mL. Após 70 dias, os animais foram sacrificados e as concentrações de F no plasma e no fêmur foram determinadas. A fluorose foi determinada através do método de análise da superfície do esmalte, Dental Fluorosis by Image Analysis(DFIA), baseado na diferença da intensidade média dos pixels das estrias claras (maior intensidade) e escuras (menor intensidade). As estrias são identificadas por segmentação de recortes em escala de cinza (690x170 pixels) das imagens digitais obtidas dos incisivos inferiores. Foi observado um aumento linear significativo na concentração de F no plasma e osso de acordo com o aumento da concentração de F na água (r=0,89 e 0,98, respectivamente, p<0,0001). O índice de fluorose (média±DP, n=5) para os grupos 0; 12,5; 25; 50; 62,5; 75 e 100 μg F/mL foram, respectivamente: 1,3±0,1; 2,1±0,3; 2,9±0,2; 4,7±1,1; 5,4±3,1; 4,7±1,2; 9,5±3,8; com uma correlação linear significante (r=0,77, p<0,0001). Os resultados sugerem que o índice DFIA desenvolvido é um método simples e preciso que pode ser usado com sucesso para quantificar alterações induzida por F em incisivos de ratos.